1. Badania naukowe mające na celu poprawę jakości mięsa drobiowego w Polsce – badania nad Salmonellą
Niniejsze badania prowadzone są przez Krajową Federację Hodowców Drobiu i Producentów Jaj we współpracy ze spółką celową Uniwersytetu Gdańskiego oraz naukowcami tej uczelni – w ramach projektu dofinansowanego z Funduszu Promocji Mięsa drobiowego
2. Cel Projektu
Zakażenia wywoływane bakteriami z rodzaju Salmonella u drobiu stanowią obecnie jedno z wyzwań rynku drobiarskiego wpływających na ceny, rentowność produkcji oraz eksportu polskiego mięsa drobiowego. Budżet państwa, polscy hodowcy i przedsiębiorcy przemysłu drobiarskiego ponoszą istotne koszty związane z Salmonellą. Obecnie szuka się rozwiązań alternatywnych w stosunku do antybiotyków, pozwalających na ochronę drobiu i redukcję kosztów walki z bakteriami Salmonella. Jedną z dróg jest wykorzystanie naturalnych wrogów bakterii – bakteriofagów.
Zadania realizowane w ramach Projektu miały na celu pozyskanie i przygotowanie szczepów bakterii z rodzaju Salmonella, izolację materiału genetycznego z hodowli tych bakterii, przygotowanie „bibliotek” do sekwencjonowania, sam proces sekwencjonowania, analizę uzyskanych sekwencji oraz stworzenie bazy danych genomów polskich szczepów Salmonella.
Powyższe pozwoli na poznanie genotypu pochodzenia szczepu Salmonelli, a tym samym stanowić może narzędzie pomocne w obronie w przypadku fałszywego oskarżenia dot. zakażonego mięsa „polskim” szczepem poprzez porównanie prób u importera i eksportera.
Dalszym celem jest wsparcie w stworzeniu preparatów złożonych z bakteriofagów (wirusów namnażających się w komórkach bakterii, co w konsekwencji prowadzi do ich degradacji), które będą skutecznie eliminowały bakterie z rodzaju Salmonella, najczęściej występujące na terenie polskich hodowli drobiu. Wyniki niniejszego projektu będą pomocne przy realizacji dalszych badań nad stworzeniem takich preparatów.
Prowadzone badania stanowią uzupełnienie działań podejmowanych przez polskie organy zajmujące się zwalczaniem bakterii z rodzaju Salmonella (w tym w ramach krajowego programie zwalczania salmonelloz) oraz inne podmioty i docelowo mają przyczynić się do osiągnięcia niższej częstotliwości występowania zakażenia, zgodną z unijnymi celami.
3. Etapy Projektu
Projekt prowadzony był w II etapach. Kluczowym zadaniem I etapu były prace laboratoryjne związane z sekwencjonowaniem materiału genetycznego 100 wybranych najczęściej występujących na terenie polskich hodowli drobiu bądź zakładów przetwórstwa żywności, serotypów Salmonella oraz analizą tego materiału genetycznego. W ramach II etapu najistotniejsze było stworzenie banku sekwencji genomów polskich szczepów Salmonella.
I ETAP
Zadania, które zostały zrealizowane w pierwszym etapie projektu miały na celu pozyskanie i przygotowanie szczepów bakterii z rodzaju Salmonella, izolacje materiału genetycznego z hodowli tych bakterii, przygotowanie „bibliotek” do sekwencjonowania, sam proces sekwencjonowania oraz wstępna analizę uzyskanych sekwencji, przygotowująca do ostatecznego stworzenia bazy danych genomów.
W celu pozyskania szczepów Salmonella konieczne było przeprowadzenie identyfikacji serologicznej z wykorzystaniem odpowiednich surowic przeznaczonych do aglutynacji pałeczek Salmonella. Zamówiono odpowiednie surowice i następnie za ich pomocą sprawdzono wszystkie wybrane szczepy bakteryjne. W kolejnym etapie szczepy bakteryjne zostały przesiane na odpowiednie podłoża. Posiewy wykonane na płytkach z podłożem hodowlanym są używane do dalszych analiz.
Izolacja DNA wybranych szczepów bakteryjnych została przeprowadzona z wykorzystaniem zestawu do izolacji genomowego DNA z mikroorganizmów takich jak bakterie. Do izolacji DNA konieczne było przygotowanie płynnych hodowli nocnych analizowanych szczepów bakteryjnych. Zastosowanie wyżej wymienionego zestawu umożliwiło pozyskanie czystych próbek DNA o wysokiej masie cząsteczkowej. Po przeprowadzonej izolacji sprawdzono stężenie i czystość próbek DNA. Pozyskane na tym etapie próbki zostały następnie wykorzystane do sekwencjonowania DNA metodą nanoporową.
Sekwencjonowanie nanoporowe wymaga niewielkiej ilości odczytów, aby dostarczyć wystarczającą ilość informacji do sformułowania wiarygodnych wniosków. Metoda jest bardzo dokładna, ponieważ przypadkowe odczyty w trakcie sekwencjonowania rzadko się pojawiają, a w razie potrzeby mogą zostać pominięte w trakcie analizy wyników. Pierwszym krokiem było przygotowanie bibliotek polegające na dokładnym pomiarze stężenia wyizolowanego DNA bakterii, normalizacji ilości materiału genetycznego, sprawdzeniu integralności i jakości pozyskanego materiału genetycznego oraz „przyczepieniu” unikalnych dla próbki znaczników zwanych „barcodami”. Po takim procesie próbki były gotowe do sekwencjonowania. Wszystkie próbki zostały umieszczone w specjalnych „platformach” do sekwencjonowania i umieszczone w sekwenatorze.
Po zakończeniu procesu sekwencjonowania dokonano analizy zsekwencjonowanego materiału, który stanowiły szczepy bakterii z rodzaju Salmonella. Surowe dane (raw reads) zostały poddane analizie jakościowej i ilościowej, a także bardzo prostej analizie strukturalno-funkcjonalnej, co stanowi punkt wyjścia do złożenia i opisania pełnych genomów zsekwencjonowanych organizmów w celu przygotowania banku sekwencji. Analiza taka obejmowała:
– Statystykę danej puli sekwencjonowania pokazującą parametry procesu
– Automatyczne przypisanie gatunkowe dokonywane przez algorytm analizujący sekwencje 16S
– Wykresy obrazujące analizę jakości poszczególnych odczytów (rozkład długości odczytów oraz rozkład
jakości odczytów)
– Pokrycie genomowe
– Wstępne podstawowe adnotacje genomowe
Przygotowane w ten sposób dane posłużyły w następnym etapie do stworzenia banku danych genomów bakterii z rodzaju Salmonella.
II ETAP
W ramach tego etapu stworzono bank sekwencji genomów polskich szczepów Salmonella. Do wygenerowania danych, które służyć mogą jako narzędzie porównawcze, dywersyfikacyjne oraz informacyjne w kontekście sekwencji nukleotydowej materiału genetycznego, użyto platformy adnotacyjnej. Adnotacja całego genomu to proces identyfikowania interesujących cech w zestawie sekwencji genomowego DNA i oznaczania ich przydatnymi informacjami. Użyta platforma to narzędzie programowe do opisywania genomów bakterii, archeonów i wirusów oraz tworzenia zgodnych ze standardami plików wyjściowych. Użycie takiego narzędzia jest możliwe dzięki integracji wielu algorytmów analizujących sekwencje i porównujących je z dostępnymi bazami danych. Efektem prac jest bank sekwencji polskich szczepów Salmonnella.
Był to niezwykle ważny etap, bowiem skutkował on nie tylko poznaniem sekwencji najczęściej występujących bakterii Salmonella ale także pozyskaniem kolekcji szczepów tychże bakterii. Kolekcja ta posłużyć może do izolacji ze środowiska szczepów bakteriofagów skutecznie niszczących wszystkie serowary Salmonella zebrane w kolekcji. W ten sposób przygotowane i sprawdzone terapeutyki mogą docelowo służyć do zwalczania Salmonelli w sposób alternatywny do antybiotyków.
Dodatkowo powstała kolekcja może być bazą weryfikującą pochodzenie zakażeń bakteriami Salmonella polskich eksportowanych produktów spożywczych (mięsa oraz jaj) np. w postępowaniach o odszkodowania czy zakazie sprowadzania tychże produktów. Dodatkowo taka baza mogłaby pełnić rolę głównego źródła polskich szczepów służących do weryfikacji zakażeń zagranicą polskich szczepów bakterii Salmonella (co wymaga jej aktualizacji/uzupełniania).
